Precise secondary and tertiary structure formation is critically important for the cellular functionality of ribonucleic acids (RNAs). RNA folding studies were mainly conducted in vitro, without the possibility of validating these experiments inside cells. Here, we directly resolve the folding stability of a hairpin-structured RNA inside live mammalian cells. We find that the stability inside the cell is comparable to that in dilute physiological buffer. On the contrary, the addition of in vitro artificial crowding agents, with the exception of high-molecular-weight PEG, leads to a destabilization of the hairpin structure through surface interactions and reduction in water activity. We further show that RNA stability is highly variable within cell populations as well as within subcellular regions of the cytosol and nucleus. We conclude that inside cells the RNA is subject to (localized) stabilizing and destabilizing effects that lead to an on average only marginal modulation compared to diluted buffer.

Eine korrekte und präzise Faltung der Sekundär- und Tertiärstruktur ist von entscheidender Bedeutung für die zelluläre Funktionalität von Ribonukleinsäuren (RNA). Faltungsstudien von RNA wurden allerdings überwiegend in vitro durchgeführt, ohne die Möglichkeit solche Experimente in vivo zu validieren. In dieser Arbeit konnten wir die Faltungsstabilität einer RNA-Haarnadel direkt in lebenden Säugerzellen auflösen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Faltungsstabilität innerhalb der Zelle mit der in einer verdünnten physiologischen Pufferlösung vergleichbar ist. Die In-vitro-Verwendung von künstlichen Crowding-Reagentien, mit der Ausnahme vom hochmolekularen PEG, führt hingegen zu einer Destabilisierung der Haarnadel, die aus Oberflächenwechselwirkung und Verminderung der Wasseraktivität resultiert. Ferner ist die Faltungsstabilität der RNA äußerst variabel, sowohl innerhalb einer Zellpopulation als auch auf der subzellulären Ebene des Zellkerns und des Zytoplasmas. Demzufolge unterliegt die RNA im Inneren der Zelle (lokalisierten) stabilisierenden und destabilisierenden Effekten, die im Mittel und im Vergleich zu der verdünnten Pufferlösung nur eine geringfügige Modulation der Faltungsstabilität verursachen.

Biomolecules evolve and function in densely crowded and highly heterogeneous cellular environments. Such conditions are often mimicked in the test tube by the addition of artificial macromolecular crowding agents. Still, it is unclear if such cosolutes indeed reflect the physicochemical properties of the cellular environment as the in-cell crowding effect has not yet been quantified. We have developed a macromolecular crowding sensor based on a FRET-labeled polymer to probe the macromolecular crowding effect inside single living cells. Surprisingly, we find that excluded-volume effects, although observed in the presence of artificial crowding agents, do not lead to a compression of the sensor in the cell. The average conformation of the sensor is similar to that in aqueous buffer solution and cell lysate. However, the in-cell crowding effect is distributed heterogeneously and changes significantly upon cell stress. We present a tool to systematically study the in-cell crowding effect as a modulator of biomolecular reactions.

Biomoleküle entstehen und funktionieren in einer dicht gepackten und heterogenen zellulären Umgebung. Diese Bedingungen werden im Reagenzglas oft durch Zugabe künstlicher makromolekularer “Crowding”-Reagentien imitiert. Dennoch ist es unklar, ob solche Kosolventien tatsächlich die physikalischen und chemischen Eigenschaften der zellulären Umgebung widerspiegeln, da der zelluläre “Crowding”-Effekt bisher nicht quantifiziert wurde. Wir haben einen makromolekularen “Crowding”-Sensor, der auf einem FRET-markiertem Polymer basiert, entwickelt, um diese Effekte zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Volumenausschlusseffekte zu keiner Kompression des Sensors in der Zelle führen. Die durchschnittliche Konformation des Sensors ist dabei ähnlich zu der im verdünnten Puffer sowie im Zell-Lysat. Ferner ist der zelluläre “Crowding”-Effekt heterogen verteilt und verändert sich signifikant während eines osmotischen Schocks. Mithilfe dieser Methode lässt sich der zelluläre “Crowding”-Effekt als Regulator von biomolekularen Reaktionen systematisch untersuchen.